HPLC를 공부하다 보면 가장 먼저 마주하는 개념이 바로 역상(Reverse-phase)과 순상(Normal-phase) 크로마토그래피이다.

두 방식은 분리원리 · 고정상 · 이동상 구성 등 핵심 개념이 매우 다르기 때문에 분석 대상 물질에 따라 반드시 적절한 방식을 선택해야 한다.

오늘은 이 두 가지 크로마토그래피 방식을 구조적으로 비교하면서 어떻게 선택하고 활용해야 하는지 알아보겠다.

1. 크로마토그래피의 기본 원리

크로마토그래피는 고정상(Stationary phase)과 이동상(Mobile phase) 사이의 친화도 차이를 이용해 물질을 분리하는 기술이다.

고정상과 친화도가 높다면, 고정상에 더 오래 머무르게 되고, (머무름 시간(retention time) 증가) 이동상에 친화적이면 고정상을 빨리 빠져나가게 된다.

이 원리를 기반으로 순상과 역상이 서로 반대 개념으로 작동한다.

역상(Reverse-phase) 크로마토그래피란?

개념

역상 크로마토그래피는 비극성 고정상 + 극성 이동상 조합으로 이루어진 방식이다.

또한 현대 HPLC에서 가장 많이 사용되는 표준 방식이다.

고정상

대표적으로 C18(Octadecylsilane, ODS)을 가장 많이 쓰며, C8, C4, Phenyl, CN 등 실리카 표면에 비극성 알킬 그룹을 치환한 형태이다.

이동상

물 또는 물 기반의 용액(버퍼)과 ACN(아세토나이트릴), MeOH(메탄올) 등 극성 유기용매 혼합을 많이 사용하며, pH 조절 및 이온쌍 시약 사용이 가능하다.

분리 원리

비극성 시료는 고정상(C18)과 상호작용에 의해 강하게 흡착하여 극성이 낮을수록 늦게 용출된다. 반대로 극성 시료는 빠르게 용출된다.

즉, 극성에 의한 상호작용이 핵심이다.

장점

가장 안정적이고 재현성 뛰어나며, 물을 사용할 수 있는 것이 큰 장점이다. 대부분의 물질이 물에 어느 정도 용해가 되며, 버퍼의 사용으로 분석 범위가 넓다.

컬럼 수명도 순상에 비해 상대적으로 길고 취급이 쉽다.

단점

극성 물질의 겨우 너무 빨리 용출됨으로 인해 극성 물질의 분리에 한계가 있다.

컬럼에 충진 되어 있는 고정상이 실리카를 기반으로 되어 있기 때문에 pH 2~8의 범위를 유지하는 것이 필요하다. (특정적으로 더 강한 산성 조건에서도 사용가능한 컬럼이 있으니 분석 조건에 따라 컬럼을 잘 선택해야한다.)

순상(Normal-phase) 크로마토그래피란?

순상 크로마토그래피는 극성 고정상과 비극성 이동상을 사용한다. 크로마토그래피 초기 방식이며, 현재는 역상보다 사용 빈도가 적지만 특정 분야에서는 필수적으로 사용된다.

실리카(Silica), 알루미나(Alumina), 아미노(Amino), 시아노(CN), 디올(Diol) 등 극성기 기반의 고정상이 사용된다.

헥산(Hexane), 헵탄(Heptane), 에틸아세테이트(EA), 디클로로메탄(DCM) 등의 비극성 유기용매를 이동상으로 사용되며, 이동상 조성 변화(Gradient)가 역상보다 어렵거나 제한적이다.

분리 원리

극성 시료는 고정상과 강하게 상호작용하기 때문에 늦게 용출되며, 비극성 시료는 고정상에 낮은 상호작용에 의해 머무름 시간이 적어 빨리 용출된다.

역상에서 잘 분리되지 않는 극성 화합물 분리에 용이하며, 이성질체, 지질, 지방산 분석에 유리하다.

하지만 컬럼이 수분에 민감도가 높아 water contamination이 발생할 수 있으며, 버퍼의 사용이 제한적이기 때문에 분석의 폭이 좁다.

분석 대상에 따른 선택 기준

대부분의 유기 화합물은 역상 분석 방법이 적합하며, 제약산업의 원료 분석 및 물질의 순도 분석에 많이 사용하며, LC-MS와 호환이 잘되는 장점이 있다.

순상 분석의 경우 이성질체(isomer) 분석에 탁월하다. 이성질체의 경우 역상분석에서는 동일한 RT(Retention Time)에서 용출되는 경우가 많은데, 순상 분석의 경우 이성질체를 분리할 수 있어 많이 이용되고 있다. 또한 지질(lipid), 지방산(fatty acid), 탄수화물 분석에 많이 사용하며, TLC(Thin-Layer chromatography) 결과를 HPLC로 확대 적용할 때 사용 가능하다.

분석 시 고려해야 할 팁

순상 분석은 수분의 관리가 가장 큰 변수이다.

수분이 흡습되면 재현성 떨어지고 RT가 변할 수 있다. 분석에 사용되는 용매에도 수분이 잔류할 수 있는데 잔류하는 소량의 수분도 컬럼을 손상 시킬 수 있다. 또한 HPLC system에 잔류하는 수분도 분석에 영향을 미칠 수 있기 때문에 각별한 신경을 써야한다.

역상 분석을 행하던 HPLC에서 순상 분석을 한다면 플러싱 작업이 필요하다. 이는 HPLC system내에 잔류하는 수분을 제거하는 과정이며, 잔류하는 수분에 의해 분석 오류를 방지하기 위함이다. 반대로, 순상에서 역상으로의 전환에도 이러한 과정이 필요하다.

순상과 역상의 전환이 많은 곳에서는 관리의 편이성을 위해 용매라인을 분리해서 사용하기도 한다. 

역상 분석은 버퍼(Buffer)의pH 조절이 핵심이다. 일반적으로 많이 사용하는 컬럼의 경우 pH 2~8의 범위를 유지하는 것이 중요하고, 이를 벗어나야 할 경우에는 컬럼의 spec을 확인하여 사용가능한 컬럼을 선택하는 것이 중요하다.

역상 분석과 순상 분석 중 어떤 방식이 더 좋은가? 

답은 “분석 대상에 따라 다르다”이다. 

물에 잘 녹고 비교적 비극성 물질이라면 → 역상(Reverse-phase)

극성이 높고 Reverse-phase에서 용출이 너무 빠르다면 → 순상(Normal-phase)

일반적으로

모든 분석은 역상으로 시작하고, 필요 시 순상으로 가면 좀 더 편하게 분석 조건을 만들 수 있다.