연구실, 제약회사, 식품 분석실 등에서 가장 자주 듣는 분석 장비 중 하나가 바로 HPLC(High Performance Liquid Chromatography, 고성능 액체 크로마토그래피) 이다.

하지만 처음 접하는 사람에게는 원리 및 생소한 용어로 인하여 어렵게 느껴지기 마련이다.

이 글에서는 HPLC의 개념부터 작동 원리까지 쉽게 표현해 보겠다.

HPLC란 무엇인가?

HPLC는 복합성분이 섞여 있는 혼합물에서 각 성분을 분리·정성·정량하는 분석 기법이다.

예를 들어, 커피에는 카페인·향 성분·유기산 등이 섞여 있는데, HPLC를 이용하면 이 성분들이 각각 얼마만큼 들어 있는지 정확히 알 수 있다.

간단히 요약하면,

 “액체 용매를 이용하여 시료를 컬럼을 통과시키면서 성분을 분리하는 장비” 이다.

HPLC는 어떻게 성분을 분리할까?

HPLC의 핵심 원리는 이동상(mobile phase)과 고정상(stationary phase) 사이의 상호작용 차이이다.

이동상(Mobile Phase)

이동상은 액체를 의미하며, 주로 펌프에 의해 고압으로 밀려가는 액체용매이다.

주로 물(water), 아세토니트릴(acetonitrile), 메탄올(methanol) 등을 사용하며, 분리능을 높이기 위해 buffer solution을 사용하기도 한다.

고정상(Stationary Phase)

고정상은 컬럼을 의미하며, 정확히는 시료가 지나가는 컬럼 내부의 고정된 물질을 의미한다.

일반적으로 가장 많이 사용하는 것은 역상 컬럼 (Reverse Phase column / 대표 컬럼C18 Column) 이다.

원리

우리가 분리하고자 하는 시료에는 여러 물질이 섞여 있을 수 있다. 일반적으로 합성물질은 그 수가 적지만 천연물의 경우에는 수십가지의 물질이 섞여 있을 수 있다. 

이 물질들은 고정상과 상호작용하는 정도가 서로 다르다.

고정상과 약하게 상호작용 → 금방 빠져나옴 → 머무름 시간(Rt) 짧음

고정상과 강하게 상호작용 → 오래 머무름 → 머무름 시간 길어짐

즉, 컬럼 안에서 각 성분이 머무는 시간 차이가 ‘분리’를 만들어낸다.

앞서 C18 Column 이 많이 사용된다고 하였는데 이 컬럼은 비극성 컬럼으로 분류가 된다. 그래서 분석하고자 하는 시료 중 비극성 물질이 극성물질 보다 더 오래 상호작용을 하기 때문에 머무름 시간이 길어지고, 컬럼을 빠져나오는 시간이 오래 걸린다.

특정 성분이 컬럼을 빠져나오는 시간 → Rt(머무름 시간)

빠져나올 때 검출기에서 신호 발생 → 피크(peak) 형성

피크의 넓이(면적) = 성분의 양(정량 값)

HPLC 구성 요소 한눈에 보기

HPLC는 여러 장비가 연결된 시스템입니다.

펌프(Pump)

이동상을 고압으로 밀어주는 장치이다. 

일반적으로 4개의 라인을 사용하는데 펌프의 성능과 개수에 따라 gradient 분석을 할 때 결과가 달라지기도 한다.

시료 주입기(Injector/Sampler)

시료를 주입하며, Manual 과 Auto로 나뉘어 진다. Manual은 Syringe를 이용하여 주입해야 하는 번거로움이 있어 요즘엔 거의 사용되지 않는다. 대다수가 Auto Sampler를 사용하여 대량의 시료를 시간에 구애 받지 않고 분석할 수 있다. Auto Sampler 또한 내부에 Syringe가 장착되어 있다. 하지만 분석자가 직접 구동하지 않아도 된다.

컬럼(Column)

분리가 실제로 일어나는 공간이며, 길다란 관 속에 Silica-gel 등을 비롯한 다양한 물질이 충진 되어 있다. 앞서 설명한 것 처럼 이를 고정상이라고 부르며, 이 성질에 따라 분석의 질이 결정된다. 

검출기(Detector)

분리된 성분을 검출하는데 사용된다.  대표적으로 UV-Vis Detector, PDA Detector가 있으며, 용도에 따라 RID, FLD, ELSD 등 다양하게 사용 가능하다. 분석하기 전 분석하고자 하는 샘플의 물성을 알면 검출기의 선택이 용이하다.

데이터 시스템

신호를 그래프로 모니터에 표현해 주는 것을 의미한다. 이때 Peak 및 분석 결과를 확인하고, 적분등을 수행할 수 있다.

HPLC 분석 방식: Isocratic vs Gradient

Isocratic

Isocratic은 이동상 조성이 처음부터 끝까지 동일한 것을 의미한다. 

분석 조건의 재현성이 높으며, 단순한 혼합물 분석에 적합하다.

Gradient

분석 도중(Run Time) 용매의 비율을 조절하는 분석 방법이다. 두개의 용매라인을 사용하여 시간에 따라 하나의 용매는 비율을 점차 늘리고, 하나의 용매는 비율을 점차 줄이는 방법으로 이용한다. 이 분석 방법은 복잡한 시료나 머무름 시간이 긴 성분의 분리에 효과적이다.

HPLC에서 자주 쓰이는 용어 정리

초보자일수록 위 용어들을 이해하면 HPLC 사용이 훨씬 쉬워진다.

 HPLC는 어디에 쓰일까?

HPLC는 다양한 분야에 활용된다.

• 제약: 원료의 순도, 불순물 분석, 안정성 시험

• 식품: 카페인, 색소, 방부제 분석

• 환경: 수질 오염물질 분석

• 화장품: 함량 측정, 위해 성분 검사

• 바이오: 단백질, 펩타이드 분석(특수 컬럼 사용)

특히 규제 산업(제약·식품)에서는 품질관리를 위해 필수적인 장비이다.

HPLC의 장점과 단점

장점

다양한 성분의 분석이 가능하다. 일례로 약전에 나오는 거의 모든 물질의 순도 분석에 HPLC를 이용한다. 

높은 재현성·정확성, 정성·정량 모두 가능하기 때문에 많은 분야에서 이용한다.

단점

장비 가격이 상대적으로 높으며, 용매의 사용량이 많아 상대적으로 폐용매의 발생량이 크다.

유기용매를 주로 많이 사용하기 때문에 환경 및 안전의 문제도 발생한다. 

사용 방법 및 분석 시료에 따라 컬럼 수명이 짧아질 수 있다. 

전체적으로 사용 및 관리에 유지보수 비용 필요하다.

HPLC는 복잡한 분석 기법처럼 보이지만, 원리는 매우 단순하다.

“고정상과의 상호작용 차이로 성분을 분리하고, 그 시간적 차이를 이용해 정량까지 하는 기술”

초보자라도 원리만 이해하면 실험 결과를 훨씬 쉽게 해석할 수 있고, 문제 발생 시 원인 파악도 훨씬 빨라진다. 짧은 글이지만 많은 도움이 되었기를 바라며, 세부적으로 이어서 더욱 자세하게 다뤄보겠다.