Western blot은 단백질을 검출하고 정량화 하는 데 널리 쓰이는 대표적인 단백질 분석 기법이다.

특정 단백질의 발현 수준이나 변형 여부(예: phosphorylation)를 확인할 때 매우 강력한 도구로 활용된다.

그러나 과정이 길고 변수가 많아 실험 실패가 잦은 편이기도 하다. 

이번 글에서는 Western blot의 실험 과정(Step by Step)과 자주 발생하는 문제 해결법(Troubleshooting)을 깔끔하게 정리해보도록 하겠다.

Western blot의 실험 과정은 Step by Step으로 진행된다.

• 단백질 추출 (Protein Extraction)

먼저 세포나 조직에서 단백질을 추출한다. 이때 Protease inhibitor와 Phosphatase inhibitor를 반드시 넣어야 단백질의 분해와 변형을 방지할 수 있다.

추출 후에는 BCA assay 등을 이용해 단백질 농도를 정량화 하여 시료 간 동일한 양을 로딩 한다.

• SDS-PAGE

SDS-PAGE는 단백질을 크기별로 분리하는 과정이다.

SDS는 단백질을 변성 시켜 전하-질량 비를 균일하게 만들어 주며, 이로 인해 전기영동 시 분자량에 따라 분리가 이루어지게 된다.

작은 단백질 → 고% gel (12~15%) / 큰 단백질 → 저% gel (6~8%)

• 단백질 전이 (Transfer)

단백질 전이는 분리된 단백질을 PVDF 또는 Nitrocellulose membrane으로 옮기는 단계이다.

Wet 혹은 Semi-dry 방식으로 진행하며, 전이 효율은 Ponceau S 염색으로 간단히 확인할 수 있다.

<STERLITECH PVDF membrane / ㈜코리아사이언스 제공>

• Blocking

Blocking은 항체의 비 특이적 결합을 차단하기 위한 과정이다.

보통 5% BSA 또는 5% Skim milk 용액을 사용하며, 표적 단백질이 인산화 단백질인 경우에는 BSA가 더 적합하다.

• 1차 항체 처리 (Primary Antibody)

1차 항체는 Target protein에 특이적으로 결합한다.

보통 4℃에서 overnight incubation으로 진행하며, 항체 희석비는 제품 매뉴얼에 따라 조정한다.

항체 농도가 너무 높으면 비 특이적 밴드가, 너무 낮으면 신호가 약하게 나타나기 때문에 주의가 필요하다.

• 2차 항체 처리 (Secondary Antibody)

2차 항체는 1차 항체를 인식하며, HRP(Horseradish peroxidase) 등의 효소로 표지 되어 있다.

이 효소는 ECL (Enhanced Chemiluminescence) 시약과 반응해 빛을 내고, 이를 통해 밴드 형태로 시각화 한다.

• Detection & Analysis

발광 된 밴드는 Imaging 시스템으로 촬영한 뒤, Image J 등 이미지 분석 프로그램을 통해 밴드 강도를 정량화 한다.

이때 β-actin, GAPDH 등의 Loading control을 함께 사용하면 결과의 신뢰도를 높일 수 있다.

자주 발생하는 문제 & 해결법 (Troubleshooting)

실험 성공을 위한 꿀 팁

✔︎ 단백질은 항상 얼음 위에서 빠르게 처리할 것!

✔︎ Positive control과 Loading control을 반드시 포함할 것!

✔︎ 항체 사용 전 데이터시트에서 권장 희석 비율과 epitope 정보를 확인할 것!

✔︎ Signal이 너무 강할 경우 exposure time을 줄여 밴드 포화 방지!

✔︎ 실험 조건을 꼼꼼히 기록해, 재현 가능한 결과를 만드는 습관 들이기!

Western blot은 단순히 “밴드를 보는 실험”이 아니다.

각 단계의 원리를 이해하고 조건을 세심하게 조정해야 신뢰성 있는 데이터를 얻을 수 있다.

처음에는 실패가 잦을 수 있지만, 실험 기록을 남기고 원인을 하나씩 해결해 나가다 보면 점점 노하우가 쌓여 실험 성공률을 올릴 수 있다.